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簡(jiǎn)要描述:Cellulose DE-52 DEAE 纖維素 DE-52(1)DE52纖維素。(2)HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。(3)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。(4)1.5×50cm 層析柱;透析袋;紫外分光光度計(jì)及其他透析和層析所需的試劑和器材
詳細(xì)介紹
Cellulose DE-52 DEAE 纖維素 DE-52
產(chǎn)品信息:
纖維素DE-52提取法純化多克隆抗體
該法提取IgG簡(jiǎn)便,既可小量提取,也可大量制備。
1.批量提取法 稱取DEAE-纖維素(DE52)50g,置于1000ml燒杯中,先以蒸餾水漂浮除去細(xì)顆粒,再經(jīng)酸堿處理后,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽干,或用布氏濾斗(內(nèi)放兩層濾紙)過(guò)濾,收集濕纖維素,以降低其離子強(qiáng)度。按1ml血清加濕重5g DE52,經(jīng)過(guò)充分?jǐn)嚢?,?℃吸附1h。上清液可再如此處理一次,即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡(jiǎn)便,既可小量提取,也可大量制備。
2.Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)
【材料和試劑】
(1)DE52纖維素。
(2)HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。
(3)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
(4)1.5×50cm 層析柱;透析袋;紫外分光光度計(jì)及其他透析和層析所需的試劑和器材。
【操作步驟】 Cellulose DE-52 DEAE 纖維素 DE-52
(1)DE52纖維素的處理:DE52經(jīng)酸、堿處理,0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡。
(2)裝柱:將層析柱固定于滴定架上,柱底墊一圓形尼龍紗,出口接一細(xì)塑料管并關(guān)閉出水。將浸泡于0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沉降3~5cm高時(shí),吸除0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl,或松開出水口螺旋夾,控制流速1~2ml/min,同時(shí)連續(xù)加入DE52至所需高度。待DE52*沉降后,柱面放一圓形濾紙片。
(3)平衡:松開出水口螺旋夾,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡,控制流速為15滴/min,待流出液與洗脫液之pH值達(dá)到*時(shí),停止平衡。
(4)待提取樣品的準(zhǔn)備:將蛋白裝入透析袋里,置4℃冰箱,對(duì)0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析。
(5)加樣、洗脫與收集:用吸管吸去柱面液體,以毛細(xì)吸管沿柱壁加入樣品,樣品體積相當(dāng)于柱床體積的1%~2%,蛋白濃度為50~70mg。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進(jìn)入柱床內(nèi),并用少量洗脫液清洗柱壁;待液體進(jìn)入柱床后,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl洗脫,控制流速為14~16滴/min。分部收集器收集,紫外監(jiān)測(cè),或人工收集,以紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管280nm OD值,描繪洗脫液峰。
(6)濃縮:將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合并,裝入透析袋,以PEG濃縮至所需體積。
Tris-PO4離子交換層析法
該法在上述方法的基礎(chǔ)上稍加改良,即通過(guò)梯度洗脫,可用于血清中IgG和IgM的提取。
【材料和試劑】
(1)DE52纖維素。
(2)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
(3)1.5×50cm 層析柱;透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
(4)梯度洗脫液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4;0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4;.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4。
【操作步驟】
(1)蛋白標(biāo)本對(duì)0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4透析。
(2)DE52裝柱,并以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4平衡。
(3)加樣,以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4洗脫,紫外監(jiān)測(cè)直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。
(4)以350ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4洗脫,這一步驟可用于純化血清IgG和IgM。
(5)以125ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4梯度洗脫,總量收集250ml;重復(fù)步驟(5)。
(6)根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰,透析濃縮和保存同上。
用過(guò)的DE52可用0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性,加入0.02%疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
性狀:干燥細(xì)結(jié)晶或纖維狀
基質(zhì) 高度交聯(lián)纖維素
配基 二乙基氨基乙基
配基密度 40μmol /ml
吸附載量 180mg HSA/ml
填料的顆粒大小 50μm
zui大流速 300cm/h
pH范圍 3-10,在位清洗時(shí)pH范圍可到2-11
化學(xué)穩(wěn)定性 各種緩沖液及鹽,0.5M NaOH及醋酸,8M脲,6M鹽酸胍,乙醇,異丙醇等
物理穩(wěn)定性 0.1M中性緩沖液中,120℃30min
層析柱裝填
1)組裝柱(如有需要連接裝柱器)。
2)取下下柱頭用裝柱緩沖液沖洗柱底適配器,排除篩網(wǎng)下面的氣泡,將下柱頭安裝
在層析柱底部,旋緊調(diào)整旋鈕,并在層析柱底部保留 1cm 左右高度的液體。
3)用裝柱緩沖液重懸介質(zhì),制成 50%~75%左右的介質(zhì)懸浮液。
4)一次性將介質(zhì)倒入柱管中,避免產(chǎn)生氣泡。
5)如連接有裝柱器,立即往裝柱器中緩慢加入裝柱緩沖液。將適配器或裝柱器上蓋
與層析系統(tǒng)相連接。
6)設(shè)定所需流速+,打開柱下端,啟動(dòng)泵,進(jìn)行壓柱。
7)柱床穩(wěn)定后保持 30min 以上,關(guān)閉泵和底閥
8)如連接有裝柱器,移除裝柱器后連接適配器。
9)調(diào)節(jié)適配器,使其固定在膠面上 0.5~1cm 處,并保證適配器入口充滿液體。
10)打開底閥,連接泵,繼續(xù)用設(shè)定的流速(注意壓力不要超過(guò) 0.3Mpa)繼續(xù)壓柱
待膠面高度保持不變,標(biāo)記此時(shí)膠面高度
11)暫停機(jī)器,關(guān)閉底閥,斷開柱頭入口,調(diào)低適配器至膠面下 3~5mm 處。封閉
上柱口,裝柱完成。
蛋白層析柱/蛋白純化柱(一端柱床可調(diào),螺紋型) | |||||
內(nèi)徑(mm) | 耐壓(bar) | 床層高度(mm) | 床層體積(mL) | 床層高度(mm) | 貨號(hào)(玻璃) |
10 | 5 | 100 | 0-7 | 0-100 | LK10100 |
10 | 200 | 4月15日 | 55-200 | LK10200 | |
10 | 400 | 20-31 | 255-400 | LK10400 | |
10 | 600 | 35-47 | 455-600 | LK10600 | |
10 | 800 | 51-62 | 655-800 | LK10800 | |
10 | 1000 | 67-78 | 855-1000 | LK101000 | |
15 | 5 | 100 | 0-17 | 0-100 | LK15100 |
15 | 200 | 9.7-35.3 | 55-200 | LK15200 | |
15 | 400 | 45-70 | 255-400 | LK15400 | |
15 | 600 | 80-106 | 455-600 | LK15600 | |
15 | 800 | 116-141 | 655-800 | LK15800 | |
15 | 1000 | 151-176 | 855-1000 | LK151000 | |
20 | 5 | 100 | 0-31 | 0-100 | LK20100 |
20 | 200 | 17-63 | 55-200 | LK20200 | |
20 | 400 | 80-126 | 255-400 | LK20400 | |
20 | 600 | 143-188 | 455-600 | LK20600 | |
20 | 800 | 205-251 | 655-800 | LK20800 | |
20 | 1000 | 268-314 | 855-1000 | LK201000 | |
25 | 5 | 100 | 0-49 | 0-100 | LK25100 |
25 | 200 | 27-98 | 55-200 | LK25200 | |
25 | 400 | 125-196 | 255-400 | LK25400 | |
25 | 600 | 223-294 | 455-600 | LK25600 | |
25 | 800 | 321-392 | 655-800 | LK25800 | |
25 | 1000 | 419-490 | 855-1000 | LK251000 | |
37 | 5 | 100 | 0-107 | 0-100 | LK37100 |
37 | 200 | 59-214 | 55-200 | LK37200 | |
37 | 400 | 274-430 | 255-400 | LK37400 | |
37 | 600 | 488-644 | 455-600 | LK37600 | |
37 | 800 | 703-859 | 655-800 | LK37800 | |
37 | 1000 | 918-1074 | 855-1000 | LK371000 | |
50 | 5 | 100 | 0-196 | 0-100 | LK50100 |
50 | 200 | 108-392 | 55-200 | LK50200 | |
50 | 400 | 500-785 | 255-400 | LK50400 | |
50 | 600 | 893-1177 | 455-600 | LK50600 | |
50 | 800 | 1285-1570 | 655-800 | LK50800 | |
50 | 1000 | 1678-1962 | 855-1000 | LK501000 |
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